< User's Voice >

赤羽俊章 氏（鹿児島大学病院腫瘍センター特例助教）

脳腫瘍診断のためのカスタム遺伝子パネルの開発と検証
融合遺伝子解析はRNA収量の高い試薬キットを使用

「2019年に脳腫瘍の遺伝子診断を目指して、次世代シーケンサ（NGS）用の遺伝子パネルを独自開発し、共同研究者と検証を進めてきました。さらに今年からは共同研究先を広げ、最終的に1,000検体程度を解析する予定です。この遺伝子パネルには融合遺伝子が含まれるため、DNAだけでなくRNAも解析対象となります。FFPE検体からのDNA抽出は、これまで使ってきた試薬キットで純度も収量も十分でしたが、問題なのがRNA抽出。検体中の組織量が少ないと解析に必要なRNAを十分量回収できないことが想定されます。そのため回収率が高いRNA抽出キットを探していました」と鹿児島大学の赤羽俊章氏。赤羽氏は現在、この遺伝子パネルの核酸抽出にApplied Biosystems™ MagMAX™ FFPE DNA/RNA U l t ra K i tと自動サンプル処理システムのThermo Scienteific™ KingFisher™ Duo Prime Purification Systemを使用しています。RNA抽出キットの選択ポイントとカスタムパネルの開発を赤羽氏に伺いました。

回収率が高いRNA抽出キットを探す
「単一サンプルからDNAとRNAを回収できる試薬キットは、複数の企業から提供されていますが、多くは遠心後の上清からDNAを抽出し、沈殿からRNAを抽出するタイプ。私たちのパネルでは、1検体当たりFFPEスライド10枚を使いますが、組織量が少ないと沈殿物が目視できず、回収が困難になります。そこで回収法が異なるMagMAX FFPE DNA/RNA Ultra Kiを試してみました。このキットではDNAをビーズに吸着させて単離後、次にDNA除去上清からRNAを回収するので沈殿物の有無を目視で確認せずに済みます。問題となる回収率を従来法と比較したところ、RNA回収量は全9 検体においてMagMAX FFPE DNA/RNA Ultra Kitが多く、さらにマニュアル操作よりも自動化システムを使うと収量が上がることを確認しました。特によかった点は、従来法ではRNA回収量がゼロの検体でもこのキットではRNAが回収できたこと。私たちのNGS解析系では、FFPE検体からは核酸200ngを使います。通常はDNAとRNAを200ngずつそれぞれ6μLの溶液に溶かしてアプライします。DNAが高純度であれば、ある程度量を減らして、RNA添加量を増やすこともできますが、それにも限界があります。今回の比較からDNA回収率には両キットで大差なく、操作性は従来品の方が若干楽ですが、脳腫瘍診断用の遺伝子パネル解析にはRNA回収量が多いMagMAX FFPE DNA/RNA Ultra Kitを使うことにしました。また山梨県立中央病院ゲノム解析センターのスタッフの雨宮健司氏からKingFisher PurificationSystemを使用中と伺い、自動化装置も導入することにしました」と続けます。

脳腫瘍診断は統合的に判断する時代に
「2016年、2021年とWHOの脳腫瘍病理分類が改定され、多くの腫瘍型において組織診断だけではなく遺伝子／分子診断を含めた統合的な診断が必要になりました。現在、WHOの脳腫瘍の病理分類では7-8遺伝子に対するコピー数を含めた変異を調べることになっています。その中には、発生初期に起こるIDH1/2遺伝子変異やメチル化異常のH3-K27M変異、染色体1番短腕（1p）と19番長腕（19q）の相互転座による1p/19qの共欠失が含まれています。しかし脳腫瘍に関わる遺伝子はもっと多いとの報告もあり、私たちが開発した遺伝子パネルでは、DNA解析による50遺伝子とRNA解析による37融合遺伝子の変異解析を網羅しています。すでにこれまでの研究からWHOでは分類できないサブグループも検出しており、WHOの現分類よりもさらに多くの遺伝子の解析が今後必要になると予想されます。また脳腫瘍における遺伝子変異は予後との相関性が高いと考えられており、遺伝子診断の重要性は増すと思われます。正確な脳腫瘍診断をサポートする遺伝子パネルの開発と検証をさらに進めていきたい」と赤羽氏は最後に語ります。